Science Bulletin│Shanghai Institute of Materia Medica、腫瘍標的型リポプレックスでNKG2D CAR T/NK細胞をin situで作製し腫瘍免疫療法を増強する手法を開発

キメラ抗原受容体CAR-T細胞療法は、血液腫瘍の治療において顕著な治療効果を上げていますが、固形腫瘍の治療には依然として課題があります。従来のCAR-T細胞は、体外で増幅してから再注入する必要があり、複雑な工程、高いコスト、長い期間を要し、注入後に固形腫瘍へ効果的に浸潤することが難しいため、有効性が限られます。近年、脂質ナノキャリアを用いて体内で直接CAR細胞を作製する方法が新たな研究方向となっていますが、「精密な作製、局所での活性化、安全性と制御性」をどのように実現するかは依然として大きな課題です。そのため、CAR-T/NK細胞の作製を正確に標的化でき、良好な安全性を備えた新技術の開発が強く求められています。

こうした課題に対して、Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of SciencesのLi Yaping氏のチームとShanghai Jiao Tong UniversityのWang Dange氏のチームは、2026年8月2日、Science Bulletinに「In situ generation of NKG2D CAR T/NK cells via a tumor-targeted lipoplex for enhancing cancer immunotherapy」と題する研究成果を発表しました。本研究では、代謝調節型グルタミン酸受容体4（GRM4）を標的とし、腫瘍への浸透能を備えた脂質送達システム（R8L-NI@Lipo）を開発し、NKG2D-CARとIL-15をコードする低酸素応答性pDNAを送達することで、腫瘍組織内での精密なCARの作製を実現しました（図1）。R8L-NI@Lipoは、R8浸透促進ペプチドによって腫瘍深部への浸透を実現し、LSOP分子を用いて腫瘍組織のGRM4受容体を標的とすることで腫瘍特異的な集積を達成すると同時に、IL-15を分泌してNK細胞とCD8+ T細胞を持続的に刺激します。脂質送達システムが搭載するpDNAには、9×HREの低酸素応答配列とODD酸素依存性分解ドメインが含まれており、CARが腫瘍の低酸素微小環境でのみ発現することを保証し、正常組織におけるNKG2D-CARの非特異的な発現を低減します。研究結果によると、さまざまなトリプルネガティブ乳がん（TNBC）のマウスモデルにおいて、NKG2D CAR-T/NK細胞を腫瘍内でin situに作製でき、腫瘍の免疫微小環境を再構築し、腫瘍の増殖を有意に抑制して生存期間を延長する一方、肝臓などの正常臓器へのオフターゲット毒性を効果的に回避できることが示されました。

乳がん組織および各種の免疫細胞（T細胞、NK細胞など）におけるGRM4の高発現に基づき、研究チームは、リン酸基を含むGRM4アゴニストL-O-ホスホセリン（LSOP）で修飾したリポソームを選択し、グアニジン基を持つ八量体アルギニン（R8）を結合させて、GRM4を標的とし腫瘍血管関門を透過できるLOSP修飾R8ペプチド結合DSPE-PEジステアロイルホスファチジルエタノールアミン-ポリエチレングリコール（DSPE-PEG-R8L）担体を形成しました。このベクターは、piggyBacトランスポゾンシステムを搭載し、NKG2Dキメラ抗原受容体（CAR）とIL-15をコードし、低酸素応答配列（HRE）と酸素依存性分解ドメイン（ODD）によって制御されるプラスミドpDNA（Dzr）を効率的に圧縮できます。in vitroおよびin vivoの実験により、NKG2D CARは低酸素（≤1% O₂）条件下でのみ有意に発現し、常酸素下ではほとんど発現しないことが確認され、腫瘍の低酸素微小環境に特異的なCAR-T/NK細胞の作製が実現しました。常酸素で制御される対照プラスミド（Cme）と比較して、R8L-NI@Lipoが送達するDzrプラスミドは、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓などの正常臓器における非特異的なCAR発現を有意に減らし、白血球減少や肝機能異常などの毒性を回避しました。同時に、トランスクリプトーム解析により、このシステムが抗原提示、NK細胞の細胞傷害性、補体カスケードなどの抗腫瘍免疫経路を特異的に活性化することが示されました（図2）。皮下4T1およびEMT6マウスモデルにおいて、R8L-NI@Lipoは腫瘍内のNKG2D⁺CD8⁺ T細胞とNK細胞の浸潤を有意に増やし、グランザイムBやIFN-γなどのエフェクター分子のレベルを高め、M1マクロファージの極性化を誘導するとともに制御性T細胞を減らし、免疫微小環境を再構築しました。治療群では腫瘍体積と重量が有意に減少し（4T1モデルの平均腫瘍重量は対照群のわずか9.2%）、生存期間の中央値は22.5日から42.5日（4T1）または44.5日（EMT6）に延長され、一部のマウスでは完全寛解が得られました（図3）。本研究は、GRM4を標的とする腫瘍浸透性の脂質複合体R8L-NI@Lipoを開発し、TNBC組織において低酸素応答性のNKG2D CAR-T/NK細胞のin situ作製を実現するもので、固形腫瘍のCAR免疫療法に、新たな精密で安全かつ効率的なin situ作製戦略を提供します。

Shanghai Institute of Materia MedicaのLi Yaping研究員とShanghai Jiao Tong UniversityのWang Dange研究員が本論文の共同責任著者です。Shanghai Institute of Materia Medicaの博士課程学生Xu Xiaoxuan氏、博士研究員Yi Wenzhe氏、Jilin Universityの博士課程学生Sun Xiangshi氏が本論文の共同筆頭著者です。本研究は、Lingang Laboratoryの科学研究課題、国家重大科学技術プロジェクトなどの事業の支援を受けました。

全文リンク：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095927326008728

図1　腫瘍浸透性と低酸素微小環境応答を備えた脂質薬物送達システムR8-NI@Lipoの構築と、固形腫瘍内でのCAR-T/NKのin situ作製の原理

図2　(a) TCGAのヒト乳がん（BRCA）と正常組織におけるGRM4の発現差、(b) 患者の乳腺組織マイクロアレイ（n=40）におけるGRM4の免疫組織化学、(c) t-SNEとGRM4の発現、(d) R8L-NI@Lipoの調製工程、(e) 粒子径と透過型電子顕微鏡（TEM）、(f) DiR標識R8L-NI@Lipoの経時的なin vivo蛍光イメージング（λex/λem = 740/780 nm）、(g) 注射24時間後の血管外漏出像、抗CD31抗体（緑）、(h, i) piggyBacトランスポゾンプラスミドの構築、(j) 常酸素または低酸素処理48時間後の脾細胞上のNKG2D CARのフローサイトメトリー検出（n=3）、(k) ~100または200 mm³の腫瘍におけるHIF-1αの量、(l) HIF-1αの発現（n=3）、(m) R8L-NI@Lipo治療後の腫瘍切片の共局在マップ：EGFP（白）、HIF-1α（緑）、NKG2D（赤）、核（青）、(n) 図示領域内のシグナル強度、(o) PBSまたはR8L-NI@Lipoで前処理した48時間後の脾細胞上のNKG2D発現（n=3）、(p) 腫瘍内のNKG2Dの発現、(q, r) CD8⁺ T細胞（q）およびNK細胞（r）におけるNKG2D CARの倍数変化（n=3）、(s) 48時間の腫瘍内IL-15レベル（n=3）。

図3　(a–e) 心臓（a）、肝臓（b）、脾臓（c）、肺（d）、腎臓（e）の免疫細胞上のNKG2D CARの発現（n=4）、(f) 正常臓器の染色：IL-15（緑）、NKG2D（赤）、核（青）、(g) 白血球（WBC）密度（n=5）、(h) 血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）値（n=5）、(i) 治療と解析のタイムライン；PBS（G1）、NI（G 2）、NI@Lipo（G3）、R8-NI@Lipo（G4）、R8L-I@Lipo（G5）、R8L-N@Lipo（G6）、R8L-NI@Lipo（G7）、各群n=4、(j–l) R8L-NI@Lipoによる免疫活性化の機序：NK細胞（j）、GzmB⁺ NK細胞（k）、IFN-γ⁺ NK細胞（l）、(m–p) 腫瘍内の免疫細胞の割合：CD8⁺ T細胞（m）、GzmB⁺ CD8⁺ T細胞（n）、IFN-γ⁺ CD8⁺ T細胞（o）、制御性T細胞（Tregs）（p）、(q) 4T1腫瘍モデルにおける腫瘍増殖曲線（n=6）、(r) 15日目の腫瘍重量（n=6）、(s) 生存曲線と生存期間中央値（MST）、(t) EMT6腫瘍増殖曲線（n=6）、(u) 体重変化曲線（n=6）、(v) 腫瘍の生存曲線とMST。

（寄稿部門：Li Yaping研究室、寄稿者：Yi Wenzhe氏、査読者：Diao Wentong氏、編集者：Song Wenke氏）